Főbb tervezési szempontok a génterápiás termékek vírusürítésének validálási vizsgálati protokolljaihoz

ICH Q5A(R2)-Nemzetközi Harmonizációs Alapítvány

Az ICH Q5A(R2) hivatalosan 2023. november 1-jén került elfogadásra, és a vírusbiztonsági értékelés alapvető nemzetközi útmutatója. Az 1999-ben megjelent Q5A(R1)-hez képest az R2 verzió jelentős frissítései a következők: egy újonnan hozzáadott fejezet a folyamatos gyártás vírusbiztonsági értékeléséről (7. fejezet); a kockázatértékelés megerősített szerepe a vírusmentesítési stratégiák alapjaként; a következő generációs szekvenálás (NGS) beépítése a vírusészlelési szempontok közé; valamint az új termékek és gyártási eljárások értékelésére vonatkozó kifejezett követelmények. A Q5A(R2) szabványt a szabályozó hatóságok, köztük az FDA, az EMA és a PMDA fogadták el, egységes technikai keretet biztosítva a vírusmentesítés validálásához világszerte.

NMPA{0}}Kínai szabályozási rendszer

Az NMPA vírusbiztonsági szabályozási kerete több szintet fed le:

Dokumentumszint	Dokumentum neve	Kibocsátási év
Alapító dokumentum	Műszaki irányelvek a vírusok vérkészítményekből történő eltávolításához/inaktiválásához	2002
Alapító dokumentum	A biológiai szövetek vírusbiztonsági értékelésének általános elvei{0}}származékok és eukarióta sejtek{1}}	2005
Termékspecifikus irányelv{0}	Műszaki irányelvek a rekombináns adeno{0}}asszociált vírus (rAAV) vektor-alapú in vivo génterápiás termékek gyógyszerészeti kutatásához és klinikai vizsgálati alkalmazásainak értékeléséhez	2023
Termékspecifikus irányelv{0}	A rekombináns adeno{0}}asszociált vírus (rAAV) vektor-in vivo alapú génterápiás termékek gyógyszerészeti minőségének általános műszaki követelményei a forgalomba hozatali engedélyezési kérelmek számára	2025
Innovatív irányelv	Technikai irányelvek a terápiás rekombináns fehérjetermékek klinikai vizsgálati alkalmazásaihoz szükséges víruseltávolítási folyamatok platformon történő validálásához (próba)a	2024

a: Ez az iránymutatás az első alkalom, hogy a kínai szabályozó hatóság szisztematikus műszaki követelményeket támaszt a vírusmentesítési folyamatok platformellenőrzésére, és összhangban van az ICH Q5A(R2) szellemével.

Az FDA és az EMA{0}}USA és európai szabályozási követelményei

Az FDA 2024 januárjában hivatalosan kiadott egy iparági útmutató dokumentumot az ICH Q5A(R2) alapján. Ezenkívül az Egyesült Államok Gyógyszerkönyve (USP) fejezete<1050.1>kiegészítő műszaki útmutatást ad a vírusmentesítési eljárások tervezéséhez, értékeléséhez és jellemzéséhez. Az FDA kétévente vírusmentesítési szimpóziumot szervez; a 2023-as szimpózium olyan élvonalbeli témákkal- foglalkozott, mint az új modalitások, a folyamatos gyártás, az új kromatográfiás közegek és az adszorpciós szűrők. Az EMA alapvető útmutató dokumentumai közé tartozik a CPMP/BWP/268/95 (Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inaktivation and Removal of Virus) és az EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 Biotechnologicaluidevaluigline on VirusG termékek), amelyek mindegyike harmonizálva lett az ICH Q5A(R2).

A vírusfertőzési források azonosítása

Az ICH Q5A(R2) hangsúlyozza, hogy a víruseltávolítás validálásának megtervezésének átfogó kockázatértékelésen kell alapulnia. A génterápiás termékek esetében a vírusfertőzési források azonosításának a következő szinteket kell figyelembe vennie:

Sejtbanki szint: Endogén vírusok (pl. retrovírus részecskék) és látensen fertőző vírusok, amelyek potenciálisan a termelő sejtszubsztrátumokban találhatók (pl. HEK293, CHO, HeLa). A HEK293 sejtekről ismert, hogy endogén Ad5 E1 szekvenciákat és egy körülbelül 900 bp méretű EBV fragmentumot tartalmaznak, és képesek replikációs kompetens adenovírust expresszálni; ezért a kockázatértékelés során különös figyelmet kell fordítani erre a kockázatra.

Helper vírus szintje: Az AAV vektor előállítása általában olyan módszereket alkalmaz, mint a segítő plazmidok segítségével történő hármas transzfekció, amely magában hordozza a replikációs -kompetens adenovírus (RCA) létrehozásának kockázatát. Hasonlóképpen, a lentivírus-vektor-termelésben használt csomagolósejtek replikációs -kompetens lentivírust (RCL) generálhatnak.

Nyersanyagszint: Adventív vírusok bejuthatnak a gyártás során használt nyersanyagokon keresztül, beleértve a sejttenyésztő táptalajokat, takarmányokat és enzimeket. Ez a kockázat különösen jelentős, ha állati eredetű összetevőket (pl. szarvasmarha-magzatszérum, tripszin emésztési oldatok) használnak.

Kockázati különbségek: génterápia vs. hagyományos rekombináns fehérjék

Kockázati dimenzió	Hagyományos rekombináns fehérjetermékek	Génterápiás termékek
Vírusforrás	Endogén vírusok sejtbankból; járulékos vírusok	Sejtbank-vírusok; segítő vírusok; replikációs{0}}kompetens vektorok (RCV/RCL); gazda genom integrációja
Sejtszubsztrát	CHO, NS0, Sp2/0 és más jól -karakterizált sejtvonalak	HEK293, HeLa, CHO stb.; egyes sejtvonalak tumorigén eredetűek
A termék jellemzői	fehérje{0}}alapú gyógyszer; jól-definiált szerkezet	Vírus vektor; biológiai biztonsági kockázatot jelent
Érvényesítési stratégia	Több-lépcsős vírusmentesítés; a hangsúly a folyamatlépések érvényesítésén van	RCV/RCL észlelés szükséges; az érvényesítés és a tesztelés egyaránt elengedhetetlen
Platform érvényesítés	Alkalmazható olyan bevált eljárásoknál, mint az S/D, alacsony pH-érték, nanoszűrés	Korlátozott alkalmazhatóság a vektortípusok sokfélesége miatt

1. táblázat: A vírusbiztonsági kockázatok összehasonlítása: génterápiás termékek vs. hagyományos rekombináns fehérjetermékek

Általános alapelvek

Az indikátorvírus-szelekció központi eleme a víruseltávolítási validációs protokollok tervezésének. Az ICH Q5A(R2) megköveteli, hogy az indikátorvírus-kiválasztás a kockázatértékelésen alapuljon, és vegye figyelembe a következő tényezőket:

A vírus jelentősége a termelő sejtszubsztrát szempontjából (releváns vírus)

A vírus fizikai-kémiai tulajdonságai (burkos/nem{0}}burkos, DNS/RNS, mérettartomány)

A vírus ellenállása a fizikai/kémiai kezelésekkel szemben

A vírus kimutathatósága és biológiai biztonsága

A génterápiás termékek esetében az indikátorvírus-szelekciónak a következőket is figyelembe kell vennie: magának a vektorvírusnak, mint „releváns vírusnak” a szerepét; a segítő vírus fertőzésének lehetséges kockázata; valamint a replikációs{0}}kompetens vírusok (RCV/RCL) észlelési és érvényesítési követelményei.

Ajánlott Indicator Virus Panel

Vírus	Írja be	Boríték	Genom	Méret (nm)	Kiválasztás indoklása / alkalmazás
MVM	Parvovírus	Egyik sem	ssDNS	18–26	nem{0}}borítékolt modell; legkisebb méret és legnagyobb ellenállás; alkalmas nanoszűrés validálására (általában nem alkalmazható rAAV vektor termékekre)
PPV	Parvovírus	Egyik sem	ssDNS	18–26	nem{0}}borítékolt modell; általánosan használt indikátorvírus a vérkészítményekhez
Reo-3	Reovírus	Egyik sem	dsRNS	60–80	nem{0}}borítékolt modell; közepes méretű; magas fizikai stabilitás
PRV	Herpesviridae	Igen	dsDNS	150–200	Borítékolt modell; nagy méret; széles gazdakör
X-MuLV	Retrovírus	Igen	ssRNS	80–110	Burkolt retrovírus modell; megfelelő a CHO{0}}eredetű sejtszubsztrátokhoz
BVDV	Flaviviridae	Igen	ssRNS	40–60	Borítékolt modell; kémiai inaktiválási módszerek értékelésére használják (HCV helyettesítő)
VSV	Rhabdoviridae	Igen	ssRNS	70	Borítékolt modell; széles pH-tolerancia; alacsony{0}}pH inaktiválás ellenőrzésére alkalmas

2. táblázat: A génterápiás termékek vírusmentességének validálásához javasolt indikátor vírus panel

Különleges szempontok az AAV Vector termékeknél

A rekombináns AAV-vektortermékek esetében az NMPA Technical Guidelines for Pharmaceutical Research and Evaluation of Clinical Trial Applications for rAAV Vector{0}}Based In Vivo génterápiás termékek esetében figyelmet kell fordítani a replikáció{1}}kompetens AAV (rcAAV) kimutatására. Az rcAAV autonóm replikációra képes AAV-ra utal, amely jellemzően a segítő plazmid és az AAV termék genomja közötti homológ rekombinációból származik. Az rcAAV kimutatását általában fertőző tesztekkel vagy qPCR-módszerekkel végzik, külön-külön a hatóanyagon és a tisztított terméken.

Érdemes megjegyezni, hogy az AAV vektortermékek downstream tisztítási folyamatai jellemzően magukban foglalják a nukleázos emésztést, a kromatográfiát (AEX), a nanoszűrést és az ioncserélő kromatográfiát (CEX/IEX). A hagyományos víruseltávolítás validálása során ezek a folyamatlépések magának az AAV-vektornak a jelentős elvesztését eredményezhetik; ezért a vektor és az indikátorvírusok közötti kölcsönhatást gondosan mérlegelni kell a skálázási-modell tervezése során. Bizonyos folyamatlépéseknél (pl. nanoszűrés), ahol az AAV vektor veszteségei jelentősek, értékelni kell, hogy a validációs adatok alapján indokolt-e a folyamat módosítása (pl. nanoszűrő membrán pórusméretének beállítása).

Általános alapelvek

A skálázható-modell (SDM) a vírusmentesítés ellenőrzésének alapvető eszköze; kialakításának pontosan tükröznie kell a gyártási folyamat vírusmentesítési teljesítményét. Az ICH Q5A(R2) 6.2.2. szakasza kifejezetten előírja, hogy a kicsinyítési A génterápiás termékek esetében a következő szempontok különösen fontosak az SDM tervezésénél:

A kritikus folyamatparaméterek reprezentativitása

A kicsinyítési terhelési arány (vektor/felülúszó fehérje tömegarány); érintkezési idő és hőmérséklet; áramlási sebesség/tartózkodási idő; a termék tisztasága és összetétele. Az AAV termékek esetében külön foglalkozni kell a vektor szemcseméret-eloszlásának és az üres kapszidtartalomnak a nanoszűrési teljesítményre gyakorolt ​​hatásával is.

Modell képesítési követelmények

Az ICH Q5A(R2) megköveteli a méretarányos -lefelé modell megfelelő minősítését, beleértve: a termékminőségi jellemzők összehasonlítását (pl. tisztaság, visszanyerés, sűrűség); a kritikus folyamatparaméterek konzisztenciájának minősítése; és gondoskodni kell arról, hogy a kicsinyítési-modell rögzítse a gyártási folyamat folyamati változatosságát. A kromatográfiás lépéseknél a csúcsprofil, az elúció és a mosás konzisztenciáját kell minősíteni; nanoszűrési lépéseknél igazolni kell a térfogati kapacitás és a termékösszetétel hatásait.

LRV számítási képlet

A log redukciós érték (LRV) a vírus clearance hatékonyságának mérésének alapvető mérőszáma. Az ICH Q5A(R2) 6.5. szakasza részletes leírást ad az LRV számítási módszereiről és a statisztikai kezelésről. Az alapvető LRV-számítási képlet a következő: LRV=log₁₀(N₀/N), ahol N₀ a kezdeti vírustiter a vírus feltűnése után, és N a maradék vírustiter a folyamatkezelés után. Ha a maradék vírustiter a vizsgálat kimutatási határa alá esik, olyan becslési módszereket kell alkalmazni, mint például a Poisson-eloszlás (pl. nagy-térfogatú tesztelés).

A bizalmi intervallumok alkalmazása

Az ICH Q5A(R2) és az EMA CPMP/BWP/268/95 is megköveteli az LRV számítási eredményeinek konfidenciaintervallumának értékelését. Általában 95%-os konfidencia intervallumot alkalmaznak.

A hatékonyság kritériumai

Az NMPA vérkészítményekből származó vírusok eltávolítására/inaktiválására vonatkozó műszaki irányelvei szerint a vírus 4-nél nagyobb vagy azzal egyenlő csökkenése azt jelzi, hogy az eljárási lépés hatékony a vírus eltávolítására/inaktiválására. Ez a kritérium azonban nem abszolút küszöb, és holisztikus módon kell értékelni az inaktivációs kinetikai görbékkel, az indikátorvírus-szelekció tudományos indoklásával és a validációs protokoll tervének általános megalapozottságával együtt. A génterápiás termékek esetében különös figyelmet kell fordítani a kumulatív kiürülési kapacitásra az összes eljárási lépésben annak biztosítása érdekében, hogy az általános vírusbiztonsági profil elfogadható szinten legyen.

A nanoszűrés alkalmazása és kihívásai

A vírus-visszatartó szűrés (nanoszűrés) a víruseltávolítás kritikus lépése a génterápiás termékek downstream tisztításában. A tipikus vírus{2}}megtartó szűrők pórusmérete körülbelül 20 nm. A nanoszűrés vírustisztítási mechanizmusa elsősorban a méret-alapú kizáráson alapul, és hatékonyan képes eltávolítani a legtöbb vírust, amely nagyobb, mint a membrán pórusmérete, beleértve a burokkal nem rendelkező, kis parvovírusokat, például az MVM-et és a PPV-t.

A génterápiás termékek nanoszűrése azonban egyedi kihívásokkal néz szembe: az AAV vektorok mérete (kb. 20-26 nm) hasonló bizonyos indikátorvírusokéhoz (pl. MVM, 18-26 nm), ami a vektor-visszanyerés csökkenését eredményezheti; az üres kapszidok befolyásolhatják a szűrési fluxust és a vírusvisszatartás hatékonyságát; a minta viszkozitása jelentősen megnőhet a vektorkoncentrációval. Ezért a nanoszűrés validálásához szükséges SDM-tervezésnek teljes mértékben figyelembe kell vennie a vektor szemcseméret-eloszlásának és az üres kapszidtartalomnak a szűrési teljesítményre gyakorolt ​​hatását, és meg kell fontolni a nagyobb pórusméretű nanoszűrő membránok használatát, ha megfelelő.

A kromatográfiás lépések vírus clearance-ének értékelése

Az ioncserélő kromatográfia (IEX) az AAV-termékek tisztítási folyamatainak egyik alapvető lépése, amely jellemzően nukleázos emésztést, majd anioncserélő kromatográfiát (AEX) alkalmaz az üres és hibás kapszidok befogására, vagy kationcserélő kromatográfiát (CEX) a teljes kapszidok finom tisztítására. A kromatográfiás lépésekben a víruseltávolítási mechanizmusok közé tartozik a méretkizárás, az elektrosztatikus kölcsönhatások, az affinitási kölcsönhatások és egyéb tényezők. Az FDA 2023 Viral Clearance Symposium megbeszélései rávilágítottak arra, hogy a kromatográfiás lépések vírustisztítási hatékonyságát több tényező befolyásolja, beleértve a terhelési kapacitást, a pH-t, a vezetőképességet és a gyanta ciklusát; az átfogó értékeléshez többtényezős ortogonális tervezési megközelítést kell alkalmazni.

Vírusbiztonsági ellenőrzés a folyamatos gyártásban

Az ICH Q5A(R2) újonnan hozzáadott 7. fejezete speciális követelményeket határoz meg a vírusbiztonsági értékelésre a folyamatos gyártás során. A génterápiás termékeknél a folyamatos gyártás fontos fejlesztési irány lett, de új vírusbiztonsági kihívásokat is bevezet. A folyamatos gyártás során alkalmazott vírusbiztonsági ellenőrzési stratégiák a következők: -soron belüli vírusgátló szűrők, mint kritikus elszigetelési intézkedések; a tartózkodási idők és a folyamatfolyamatok megfelelő tervezése; inaktiválási lépések beépítése meghatározott tartási időkkel; és a folyamatelemző technológia (PAT) továbbfejlesztett alkalmazása a kritikus folyamatparaméterek valós idejű -figyeléséhez.